• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1988008006A1
    申请号:PCT/JP1988/000353
    申请日:1988-04-07
    公开日:1988-10-20
    发明作者:Hiroshi Kawakami；Morimasa Tanimoto；Shunichi Dousako
    申请人:Snow Brand Milk Products Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 硫酸エ ス テル化物を用 いて乳か ら ラ ク 卜 フ ユ リ ン を分 離、 精製す る 方法
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明 は 、 種々 の生理的活性を有 し 、 薬理学的 に も 重要な乳蛋 白質であ る ラ ク 卜 フ リ ン を 、 それを含有 す る 乳か ら有効に分離、 精製す る方法に関す る 。
    [0005] 景
    [0006] 背
    [0007] ラ ク 卜 フ リ ン は、 乳等の外分泌液中 に存在す る鉄 結合性の糖蛋 白質であ っ て 、 病原術性殺菌に対す る 静菌 作用 、 白血球の分化調節作用及び殺菌力増強作用 、 リ ン パ球の増殖作用及び鉄吸収調節作用等の種 々 の生理 的活性 を有す る た め、 栄養学的のみな らず薬理学的 に も 重要な乳蛋 白質であ る と い え る 。
    [0008] し た が っ て 、 従来か ら も乳か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分 離、 精製す る 方法が検討さ れて き た。 し か し 、 ラ ク 卜 フ ユ リ ン は非常 に反応性 に富ん だ分子構造を有す る 蛋 白質で あ り 、 かつ他の乳蛋 白質 と も相互作用 を示す た め 、 高純度の ラ ク 卜 フ ェ リ ン を 、 簡易 な操作に よ り 高 収率で分離、 精製す る のが困難であ っ た。 す なわ ち、 高純度の ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分離す る に は、 工程が煩雑 と な り 、 ま た分離に長時間 を要 し 、 力□ う る に ラ ク ト フ ェ リ ン の回収率 も著 し く 低い と い う 問題があ っ た。
    [0009] 最近、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン分離精製法 と し て 、 セ フ ァ ロ —ス Cい 6 B ( フ- 'ア ルマ シア社製） の よ う なク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー用担体に CNBrな ど に よ り 、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン に 対 して生物学的親和性を持つへパ リ ン を固定化 し た ァ フ ィ ニティ 一カ ラ ム に、 原料液を通 し て ラ ク ト フ エ リ ン分離、 精製する方法 [ Blackberg, L. et al 「エ フ ィ ー ビ一 エス レ タ ーズ J (F E B S LETT. ) 109, 180 (1980) ]が報告された。
    [0010] し か し 、 へパ リ ン は豚や牛な どの肝臓又は腸か ら抽 出精製さ れた も のであ り 、 その抽出源の違い に応じへ ノ リ ン の性状 も異なる ため、 同一性状のへパ リ ン を大 量 に入手す る の は困難であ り 、 かつ高価であ る 。 し た がっ て 、 へノ リ ン を結合さ せて固定化 し たァ フ ァ ニテ ィ ーク ロ マ ト グラ フ ィ ー用担体を用 いて、 乳か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン分離、 精製する方法の実施は、 実験的規模 に限 ら れ、 大量の乳を処理す る工業規模では実用性が 乏 し い。 さ ら に、 上記方法では、 担体に固定化させた へパ リ ン が脱落 し て 、 分離されたラ ク 卜 'フ ェ リ ン に混 入す る 恐れ も あ る と い う 問題も あ る 。
    [0011] 発 明 の 開 示
    [0012] 本発明 の第 1 の 目 的は、 乳か ら ラ ク ト フ リ ン を簡 易 な操作に よ り 工業的規模で分離 ' 精製す る方法を提 供す る こ と に あ る 。 本発明 の第 2 の 目 的は高純度かつ 高収率で極めて効率的 に、 乳か ら ラ ク ト フ ヱ リ ン を分 離 · 精製す る ための方法を提供す る こ と にあ る 。 本発明の特徴は、 架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸ェ ス テル化物 に 、 ラ ク ト フ ヱ リ ン含有原料乳を接触さ せ て ラ ク 卜 フ ェ リ ン を吸着さ せ、 次いでそ の吸着された ラ ク 卜 フ ェ リ ン を溶出 し て回収す る こ と に あ る 。
    [0013] 発明 を実施す る ための最良の形態
    [0014] 本発明 で用 い る架撟型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル化物 は 、 へノ リ ン と 同様な ラ ク 卜 フ ェ リ ン に対す る 生物学的親和性を有 し 、 し か も それよ り 物理的安定 性の優れ .た も のであ る 。 該硫酸エス テル化物は、 ァガ ロ ー ス 、 セ ル ロ ース並びに キ チ ン な どの ポ リ サ ヅ カ ラ ィ ド を架橋剤 [例え ばェ ピク ロ ル ヒ ド リ ン な ど ] で架 橋 し た も の （市販さ れて い る ） を 、 無水硫酸や ク ロ ル スルホ ン酸な どで硫酸エス テル化 し て得 られる も ので あ っ て 、 大量 に調製 し得る 。
    [0015] し か し 、 ァ ガロ ース は軟 ら か く 変形 し易い ため、 ラ ク 卜 フ エ リ ン を工業的規模で取得す る こ と を 目 的 と す る 場合 に は 、 セル口 一スゃ キチ ン等硬質の担体を用 い る 方が望 ま し い。
    [0016] こ の よ う な架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル 化物は 、 水性溶媒に不溶性であ り 、 物理的安定性に優 れて い る ので 、 該硫酸エス テル化物を充塡 し て成る ァ フ ィ 二テ ィ 一力 ラ ム は工業的規模での通液操作 に も充 分耐 え る こ と がで き る 。
    [0017] 架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル化物 と し て は、 架撟型セルロ ース （ ア ミ ノ 基を有す る ） を硫酸ェ ス テル化 し た硫酸セソレ口 フ ァ イ ンや、 架橋型キ ト サン ( ア ミ ノ 基を介 して架橋） を硫酸エステル化 し た硫酸 ィ匕キ 卜 パ一ル等を例示 し得る 。
    [0018] こ れ ら の架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エステル化 物を用 いて乳か ら ラ ク 卜 フ リ ン を分離、 精製す る に は、 該硫酸エステル化物を担体 と して充塡し たカ ラ ム に原料乳を通液する か、 も し く は原料乳に上記硫酸ェ ス テ ル化物 を混合 し て 攪拌す る こ と に よ り 行 う と よ い
    [0019] 本発明では、 硫酸エステル化物 と：ラ ク 卜 フ ェ リ ン含 有原料乳 と の接触は 50°C以下の温度、 好ま し く は室温 で行 う 。 本発明では、 まず原料乳のカ ラ ムへの通液に よ り 、 カ ラ ム に対 し て吸着 し ない分を溶出させた後、 0.3M食塩水 も し く は 0.3M食塩を含む pH 5. Q〜9. Q の リ ン 酸ナ ト リ ウ ム 、 卜 リ ス - HC1、 ア ン モニ ア - HC1又はべ ロ ナール等の 0.01 M 〜 0. G 2 M 緩衝液でカ ラ ム を洗浄す る 。 次いで 0.4M〜 1.5M食塩水、 好ま し く は 1. QM食塩水 も し く は 1.0M食塩水を含む上記緩衝液を力 ラ ム に通液 し て 、 カ ラ ム に吸着 して い る ラ ク ト フ エ リ ン を溶出す る こ と に よ り 、 乳 か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分離 で き る 。
    [0020] ま た、 本発明では、 次の よ う に し て ラ ク ト フ ヱ リ ン を分離 し得'る 。 ま ず原料乳 と硫酸エス テル化物を混合 し た後 に該エステル化物をデカ ン テ一 シ ヨ ン も し く は 遠心分離 に よ り 回収す る 。 こ う し て得 られたエス テル 化物 を 0.3M食塩水又は 0.3M食塩水を含む pH 5.0〜 9.0 の緩衝液で洗浄 し 、 再びデカ ン テー シ ヨ ン も し く は遠 心分離 し てエステル化物を回収す る 。 こ う し て得 られ た エ ス テ ル化物 に 0. 4 〜 1 · 5 M食塩水 も し く は 0.4 〜
    [0021] 1. 5Mの食塩水含む上記緩衝液を加え 、 よ く 洗っ た後 に 静置す る 。 デカ ン テ一 シ ヨ ン又は遠心分離に よ っ て上 澄液を 回収す る こ と に よ り 乳か ら ラ ク ト フ ヱ リ ン を分 離 し得 る 。
    [0022] 分離さ れた ラ ク 卜 フ エ リ ン は電気透析 （ED)装置 も し く は逆浸透 （R0)装置に よ り 脱塩 し た後、 凍結乾燥 し て 4 0 で以下、 好ま し く は 4 °Cで保存す る 。 なお、 上記 方法 に よ り 、 ラ ク 卜 フ ユ リ ン を分離 し た後の上記エス テル化物は 2M食塩水で洗浄 し 、 さ ら に 0. 15M 食塩水を 通液す る こ と に よ り 再生で き る 。
    [0023] 上述 し た よ う に し て 得 ら れ た ラ ク 卜 フ ェ リ ン は 、 SDS 電気泳動図 に よ り 、 純度 95 %以上であ る こ と が確 認さ れる 。
    [0024] 本発明 に お いて用 し、 られる 原料乳 と し て は、 ヒ 卜 並 びに牛や山羊等の哺乳動物の初乳、 移行乳、 常乳、 末 期乳等 を例示で き 、 さ ら に低温殺菌 し た乳及びホエ ー 等 も 挙げ られ る 。
    [0025] 本発明 に従 っ て 、 こ れ ら の原料乳か ら ラ ク 卜 フ ェ リ ン を分離、 精製する と 、 従来法にみ られる操作や工程 の煩雑さ に起因する 、 処理時間の長い こ と 及び回収率 の低い こ と 等の問題が解決される 。
    [0026] すなわち 、 本発明 に よ る と 、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン を高純 度でかつ高収率で回収で き る 。 特に、 本発明では、 物 理的安定性の優れた架撟型ポ リ サ ツ カ ラ イ ド硫酸エス テル化物のみを用 いて乳中の ラ ク 卜 フ エ リ ン を吸着す る も のであ る か ら、 従来のへパ リ ン を固定化 し たァ フ ィ ニティ 一 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一用担体を用 い る場合に み られる よ う なへパ リ ンが担体か ら脱落す る等の懸念 がない。 さ ら に、 本発明では、 吸着 し たラ ク ト フ エ リ ン が食塩水のみの使用で容易に溶出で き る ので、 分離 操作を極めて効率的 に行 う こ と がで き る 。
    [0027] ま た、 本発明で用 い られる架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド 硫酸エ ス テル化物は、 資源的に豊富なセルロ ースゃキ チ ン を原料 と す る架撟型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド を硫酸エス テルイヒ し て得 られる ので、 大量に調製で き安価に入手 し得る 利点があ る 。
    [0028] さ ら に、 本発明 に従っ て分離、 精製さ れたラ ク ト フ エ リ ン は 、 そ の 鉄 結 合 能 を W 00 d w 0 r t h ら の 方 法 ( 「プ ロ タ イ ド ス ノ イ ォ ロ ジカ ル フ ル一ィ ド ス プロ シーデ イ ン グ コ ロ キ ュ ーム 」 （Protides Biol. Fluids Proc. C o 11 o q . ) 14 , 37 ( 19669 ) に準 じ て lj定 し た結果、 ラ ク ト フ ヱ リ ン lg 当 り 1.3 〜 2. 1 mgの鉄結 合能を示す こ と か ら 、 本来の鉄結合能を保有 し て い る こ と が立証 さ れる 。 し たがっ て 、 本発明 に よ り 得 られ る ラ ク 卜 フ リ ン は、 鉄要求性病原菌に 由来す る乳児 の感染防御の ため に予防薬及び該病原菌に よ っ て も た ら さ れ る 各症状の治療薬 と し て利用 で き る 。
    [0029] さ ら に 、 本発明では、 前記方法に よ り 分離、 精製 し た ラ ク 卜 フ リ ン溶液に 、 直接塩化第二鉄を混合 し良 く 攪拌 し た後、 そ の ま ま FD装置又は R0装置に通す こ と に よ り 、 銖飽和型ラ ク 卜 フ ェ リ ン を簡易 に分離す る こ と がで き る ので、 特に腸管での鉄吸収の促進に も本発 明 は役立つ 。 因 に 、 鉄飽和型ラ ク 卜 フ ェ リ ン が腸管か ら の鉄の吸収 を向上さ せ る効果を有す る こ と は報告さ れて い る [ Cox. T. M. et 「 ノ ィ オケ ミ ア ノ 'ィ オ フ イ ジ ク ス ァ ク タ 」 （ Binchim. Biophys. Acta) 588 120 (1978) ] o
    [0030] 以下 に実施例 を示 し て本発明 を具体的 に説明 す る 。 実施例 1
    [0031] 市販の架橋セルロ ーズであ る セル口 フ ァ イ ン （商品 名 ） を常法 に よ り 無水硫酸で硫酸エス テル化 し た硫酸 ィ匕セル口 フ ァ イ ン 5( iを 、 直径 2cm , 長さ 20cmのカ ラ ム に充塡 し 、 こ のカ ラ ム に脱脂 し た ヒ 卜 初乳 5 OmJを、 10 m m i π .の速度で、 通液 し た。 次いでカ ラ ム を 0.3 M 食塩水 300iiteで洗浄 し た後、 1. 0M食塩水 I OOJUでカ ラ ム に吸着 し て し、 る ラ ク 卜 フ エ リ ン を溶出 し た。 得 られ た ラ ク ト フ ヱ リ ン溶液を +分量の脱イ オ ン水に対 し て 透析 を行 つ た後、 .凍結乾燥 し て ヒ 卜 ラ ク 卜 フ ェ リ ン l lOmg を得 た 。 回収 し た ヒ 卜 ラ ク 卜 フ ェ リ ン の純度 は、 S D S ポ リ ア ク リ ルア ミ ド ゲル電気泳動図に よ り 97
    [0032] % 測定さ れ、 鉄結合量は血清鉄測定キ ッ 卜 （和光純 薬社製） に よ り 0.2mg Fe/g蛋白質であ っ た。 ま た、 総 鉄結合能は Woodworth の方法によ り 、 100% と算定さ れた。
    [0033] 実施例 2
    [0034] 市販の架撟型キ ト サンであ る キ ト パール （商品名 ） を常法 に よ り 無水硫酸で硫酸エステル化 し た硫酸エス テル化キ ト パール 1 を、 直径 8cm , 長さ 20cmの力 ラ ム に充塡 し 、 こ のカ ラ ム に脱脂 し た牛乳 50 £ を 20 £ Z hr . の速度で通液 し た。 次いでカ ラ ム を 0 · 3 M食塩水 5 £ で洗浄 し た後、 1 · 0M食塩水 3 £ でカ ラ ム に吸着 し て い る ラ ク ト フ ヱ リ ン を溶出 し た。 得 られたラ ク 卜 フ エ リ ン溶液を小型の ED装置 （ TS-210、 徳山 ソ一ダ社製） を用 いて脱塩 し た後、 UF装置 （ DH_2、 ア ミ コ ン社製） で 10倍に濃縮 して凍結乾燥 し た。
    [0035] 回収 し た ヒ ト ラ ク ト フ エ リ ン は 6gであ り 、 純度は 95 % と測定さ れ、 ま た、 その鉄結合量は 0.2mg Fe/g蛋白 質 と 測定さ れ、 総鉄結合能は 98 %であ る こ と が確認さ れた。
    [0036] 実施例 3 本例 は 、 ラ ク ト フ ヱ リ ン を分離、 精製を 、 バ ッ チ方 式 よ り 原料乳 と 硫酸エス テル化物 と を混合 し て行 う 態 様を示す も のであ る 。
    [0037] 実施例 2 に おいて使用 し た硫酸化キ 卜 パ一ルに 0. 2M 食塩水、 つづ いて 0. 15M 食塩水を通液 し て該硫酸化キ 卜 パールを再生 し た。
    [0038] こ の再生硫酸化キ 卜 パール 1 £ と チーズホエ ー 100 •β と を 1 時間攪拌下に混合 し 、 次いで こ のゲル状の混 合物を 0. 3 Μ食塩水 5 £ で洗浄 し た。 その後、 1. 0Μ食塩 水 3 £ で上記ゲル状混合物に吸着 し て い る ラ ク 卜 フ エ リ ン を溶出 し た。 得 られた ラ ク 卜 フ ェ リ ン溶液に塩化 第二鉄 50mgを添加 し 、 よ く 攪拌 し て逆浸透装置 （ MRG 10型、 三菱 レ ー ヨ ン社製） で脱塩及び濃縮 （ 10倍） し た後、 凍結乾燥 し 、 鉄飽和型 ゥ シ ラ ク 卜 フ リ ン 4. 8g を得 た 。 回収 し た ゥ シ ラ ク 卜 フ ェ リ ン は純度は 95 % で あ り 、 鉄結合量は 1. 3mg Fe/g蛋 白質 と 測定さ れ、 総の 飽和度は 93 %以上であ る と 確認さ れた。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    ( 1 ) 架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エステル化物に、 ラ ク 卜 フ ェ リ ン含有原料乳を接触させて ラ ク 卜 フ エ リ ン を吸着さ せ、 次いで吸着ラ ク 卜 フ ェ リ ン を溶出 す る こ と を特徴 と す る 、 乳か ら ラ ク ト フ ヱ リ ン を分 離、 精製す る方法。
    (2) 前記接触が、 架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド の硫酸エス テル化物か ら成る ァ フ ィ 二テ ィ 一カ ラ ム に、 ラ ク ト フ ェ リ ン含有原料乳を通 して なされる請求項 1 記載 の方法。
    (3) 吸着ラ ク 卜 フ ェ リ ン を 0. 4〜 1..5M食塩水を含む緩 衝液で溶出 し た後、 電気透析 も し く は逆浸透に付 し て脱塩す る 請求項 1 記載の方法。
    (4) 吸着ラ ク 卜 フ リ ン を 0. 4〜 1. 5M食塩水を含む緩 衝液で溶出 し た後、 電気透析 も し く は逆浸透に付 し て脱塩す る 請求項 2 記載の方法。
    (5) 前記架橋型ポ リ サ ッ カ ラ イ ド がセルロ ース又はキ チ ン であ る 請求項 1 記載の方法。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Butler et al.1981|Nonocollagenous proteins of dentin. Isolation and partial characterization of rat dentin proteins and proteoglycans using a three-step preparative method
    EP0359593B1|1995-04-26|Séparation chromatographique des protéines du plasma, notamment du facteur VIII, du facteur von Willebrand, de la fibronectine et du fibrinogène
    Masson et al.1969|Lactoferrin, an iron-binbing protein Ni neutrophilic leukocytes
    US5149647A|1992-09-22|Process for extracting pure fractions of lactoperoxidase and lactoferrin from milk serum
    BE1004178A3|1992-10-06|Procede de preparation a l'echelle industrielle d'un concentre de facteur von willebrand humain standardise, de tres haute purete, approprie a un usage therapeutique.
    US5919913A|1999-07-06|Isolation of lactoferrin from milk
    EP0038393B1|1984-02-01|Process for recovering enzymes from blood
    US4086222A|1978-04-25|Method of isolating albumin from blood products
    JP3094167B2|2000-10-03|免疫血清グロブリンの精製方法
    CN101501059B|2014-05-14|奶中一种或多种蛋白的提取方法
    Lönnerdal et al.1982|Zinc and copper binding proteins in human milk
    US3842061A|1974-10-15|Method for isolation of antithrombin from animal tissue materials by adsorption on sulfated carbohydrate gel
    DE69637509T2|2009-05-28|Verfahren zur reinigung von faktor-ix
    Filipek et al.1996|p30, a novel protein target of mouse calcyclin |
    Chow et al.1968|Bovine Pepsinogen and Pepsin I. ISOLATION, PURIFICATION, AND SOME PROPERTIES OF THE PEPSINOGEN
    CA1146857A|1983-05-24|Process for separation and isolation of ahf,von willebrand's ristocetin cofactor |and fibronectin from blood plasma
    Azari et al.1967|A simple and rapid procedure for preparation of large quantities of pure ovotransferrin
    FI111326B|2003-07-15|Menetelmä laktoferriinin ja laktoperoksidaasin eristämiseksi maidosta ja maitotuotteista
    US4042576A|1977-08-16|Extraction of glycoproteins and sialic acid from whey
    US2961382A|1960-11-22|Urokinase-a plasmiogen activator and methods of obtaining the same
    EP0144957B1|1991-02-27|Process for purifying factor viii:c
    US6528622B1|2003-03-04|Method of separating and recovering proteins from a protein solution
    EP0253395B9|2006-07-05|A process for producing bovine lactoferrin in high purity
    US4359389A|1982-11-16|Method for the purification of interferon
    EP0123307A2|1984-10-31|Gewebeprotein PP4, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0348508A1|1990-01-03|
    JPH0725800B2|1995-03-22|
    JPS63255300A|1988-10-21|
    EP0348508B1|1992-09-09|
    NZ224200A|1990-02-26|
    DE3874527T2|1993-03-25|
    US4997914A|1991-03-05|
    DE3874527D1|1992-10-15|
    EP0348508A4|1989-10-12|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-10-20| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1988-10-20| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1988-11-14| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988903358 Country of ref document: EP |
    1990-01-03| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988903358 Country of ref document: EP |
    1992-09-09| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1988903358 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP62/88450||1987-04-10||
    JP8845087A|JPH0725800B2|1987-04-10|1987-04-10|硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法|DE19883874527| DE3874527D1|1987-04-10|1988-04-07|Trenn- und reinigungsverfahren fuer laktoferrin von milch unter verwendung einer sulfatverbindung.|
    DE19883874527| DE3874527T2|1987-04-10|1988-04-07|Trenn- und reinigungsverfahren fuer laktoferrin von milch unter verwendung einer sulfatverbindung.|
    [返回顶部]